（1）临床送检的前哨淋巴结组织必须保持新鲜，取材前不能使用氯化钠注射液、固定液或其它液体浸泡组织，如取材时用水冲洗，组织表面需用纸或纱布吸干。取材器械和取材台面要保持洁净，避免造成标本污染。取材医师用带手套的手指触摸找到较脂肪组织硬的淋巴结组织，尽可能完整剔除其表面的脂肪组织，可配合使用吸水纸或干净纱布，轻轻挤压去除表面的部分脂肪组织。
（2）较厚的淋巴结沿最大面，按约2ｍｍ的间隔剖开取材。
（3）由于不同淋巴结的转移情况存在差异，需要切片的深度可能不一样，因此以一个冷冻头放置一颗淋巴结为最佳。
（4）若一个冷冻头上需放置多颗淋巴结时，将大小及厚度相近的淋巴结并列放置于同一个冷冻头，每个冷冻头上最多不超过 3 颗淋巴结。如需将大小不等的淋巴结置于同一冷冻头上，可先在放置较小者的一侧底部垫一点包埋剂，使所放淋巴结保持在同一高度。
（5）如遇需要关注是否有前哨淋巴结周围组织侵犯时，取材需要保留一些附带的脂肪组织，不可强行剔除。
组织四周加适量包埋剂（包埋剂滴加在组织四周，少量、均匀即可，无需将组织完全埋在包埋剂中），浸入液氮或置于速冻台快速冷冻，待四周包埋剂冷冻完成后使用冷冻锤轻压在组织表面，可使组织和周围的包埋剂更平整且冷冻更迅速，可有效减少冰晶的产生。如果没有冷冻锤，可将冷冻头组织面朝下倒置于冷冻台上继续冷冻。
设置冷冻切片机机箱温（CT）－20～－25℃，冷冻头温（OT）－15～－20℃。由于工作量不同，冷冻切片机机箱内实际温度与温控温度存在差异；冷冻切片机品牌不同、设计不同、性能不同，设定的温度存在差异；同时组织大小不同适合的温度也不同，因此需要根据实际情况将设定温度略作调整。温度过低易导致淋巴结组织发脆，组织切片在镜下呈裂隙状；温度过高易导致淋巴结组织发软，切片时组织皱缩，不易获得平整无皱褶的切片。
切片厚度5～6 μｍ为宜，切片过薄（＜5 μｍ）细胞不易着色，切片过厚（＞6 μｍ）易产生裂隙，且镜下细胞重叠不利于诊断。
（1）选择组织周围包埋剂较多的位置朝下（作为最先切到位置），借助毛笔牵引切片。切片时注意用力要轻柔、均匀，避免因转速不稳导致切片厚薄不均或产生褶皱。
（2）使用防卷板切片时，可将组织下缘以下的包埋剂全部切掉后再切片，可使组织直接进入防卷板与刀锋的缝隙中，有效减少褶皱。
2.5.2 “靠岸型”淋巴结（即淋巴结四周仅局部位置脂肪组织剔除干净）
（1）选择淋巴结四周没有脂肪组织的位置朝下（作为“锚定点”位置），再借助毛笔牵引切片。切片时注意用力要轻柔、均匀，避免因转速不稳导致切片厚薄不均或产生褶皱。
（2）使用防卷板切片时，将组织下缘以下的包埋剂全部切掉，并尽可能将淋巴结周围脂肪组织及包埋剂去掉后再切片，可使组织直接进入防卷板与刀锋的缝隙中，有效减少褶皱（图1）。
2.5.3 “孤岛型”淋巴结（即淋巴结周围脂肪组织均未剔除干净）
（1）二次包埋法更适合粗修后周围脂肪组织较多而淋巴结组织较小且多颗时（图２）：
①组织周围加适量包埋剂后冷冻，粗修至所需的组织切面。
②将冷冻头拿到冷冻切片机外复温，待包埋剂稍变软后，用尖头镊子将淋巴结轻轻取出放在吸水纸或干净纱布上，仔细去掉周围多余的脂肪组织，再将淋巴结重新放置于冷冻头上进行第二次包埋。
③借助毛笔或防卷板切片（切片方法参见周围脂肪组织剔除干净的实性淋巴结）。
（2）“搭桥”法更适合粗修后周围脂肪较多且为单颗较小淋巴结时（图３）：
①组织周围加适量包埋剂后冷冻，粗修至所需的组织切面。
②将脂肪量较多的一端朝下作为“锚定点”，使用削尖的铅笔头轻轻插入该处脂肪中，将脂肪组织挤出后用纱布轻轻擦去，左右轻轻晃动铅笔，使四周轻轻探出一个“口大底小”的口袋状小凹槽，为后续的包埋剂填充留出适宜空间（注意铅笔接近淋巴结边缘时要由远及近，即由边缘脂肪组织向淋巴结组织方向划动，越靠近淋巴结动作越轻柔，避免伤及淋巴结被膜）。
③保持样本夹头固定在原位，将包埋剂挤入凹槽中，并在凹槽及其周围反复涂抹几次，确保有足量的包埋剂进入凹槽中。然后快速用冷冻锤轻压，可进一步将凹槽中的包埋剂深入推进并快速冷冻成型。
④轻轻修掉表面包埋剂，注意此时的修片动作不宜过快，进刀幅度不宜过大，边修边观察，越接近目标切面越“轻、缓、稳”。
⑤修出所需的完整切面后，借助毛笔或防卷板切片。
（1）内部脂肪化但四周仍有较多实性组织的淋巴结：可参考“靠岸型”淋巴结操作。
（2）内部脂肪化且四周均是脂肪组织的淋巴结：可参考“孤岛型”淋巴结操作。
由于淋巴结组织的冷冻切片中细胞丰富密集，淋巴细胞易收缩，细胞核染色较深，因此选择合适的固定液（既能快速固定，又有良好的固定效果）对淋巴结冷冻切片的HE染色质量有较大影响。贴片完成后应立即放入固定液中充分固定，切忌切片干燥后再固定，若不及时充分固定易造成细胞退变，细胞核模糊不清，组织原有结构丧失而影响诊断。在环境温度高或空气干燥的情况下，室温越高，细胞退变速度越快[9]。推荐使用固定液：
（1）甲醇，冷冻固定速度快，细胞收缩小，对细胞核和抗原的保存较好。
（2）AAF液（95％乙醇85 ｍＬ＋40％甲醛10ｍＬ＋冰醋酸5 ｍＬ），兼有１０％中性福尔马林和95％乙醇的作用，冰醋酸能抵消乙醇引起的细胞收缩，对抗原保存较好。
切片充分固定后，依次进行水洗（2～5ｓ）→ 苏木精染色（1～4 ｍｉｎ）→水洗（10ｓ）→蓝化（2ｓ）→水洗（30ｓ）→伊红染色（2～10ｓ）→梯度乙醇（75％乙醇，2ｓ；85％乙醇5ｓ；95％乙醇5ｓ；100％乙醇Ⅰ 5ｓ；100％乙醇Ⅱ 5ｓ）脱水→二甲苯（二甲苯Ⅰ 5ｓ；二甲苯Ⅱ 10ｓ）透明→封固（各试剂的时间不同，实验室可根据实际情况作适当调整）。所有染液需根据切片数量及时更换，以保证其浓度及足量，染色前须先用试染的切片进行试染，并根据试染结果调整染色时间。特别注意在季节交替、环境温度发生改变时，需做好切片染色的质量控制。
规范取材的前哨淋巴结，由于没有及时快速冷冻，造成切片镜下冰晶严重而影响诊断时，可通过重新快速冷冻的方法来改善：将已经加包埋剂冷冻的组织放到室温环境下复温，直至包埋剂完全融化，淋巴结组织回到取材时的状态（此时如果淋巴结周围有可去除的脂肪可进一步将其剔除干净），重新包埋后及时快速冷冻再切片，可改善部分细胞间的冰晶。
